miércoles, 2 de junio de 2010

• ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
Está en función del tamaño y de la cantidad de trabajo que en él se realice. Está dividido en secciones y éstas pueden estar individualizadas o bien todas juntas.
Secciones del Laboratorio de Microbiología:
• Sección de toma de muestras: se toman las muestras a pacientes ambulatorios; allí se almacena el material necesario para la toma, que deberá ser revisado y repuesto periódicamente.
• Recepción y registro de muestras (independientemente del lugar donde se hayan recogido las muestras).
o Registro y asignación de un número o código.
o Primera evaluación de las muestras: las muestras, dependiendo del análisis que se vaya a realizar, deben cumplir una serie de requisitos y características fijadas en el Laboratorio. Se deben rechazar las que no cumplan ese criterio pues es posible que los resultados no sean correctos.
• Sección de siembra de muestras
o Procesamiento inicial
 Siembra (en el medio de cultivo más adecuado)
 Tinción (en colorantes ácidos o básicos)
 Técnicas especiales
o Esquemas claros del procesamiento rutinario y procedimientos especiales: no son iguales de un Laboratorio a otro. Dependerá de la experiencia del profesional, entre otras cosas.
• Sección de medios de cultivo
o Preparación y lavado del material.
o Esterilización (tanto de los medios de cultivo como de los productos de desecho).
 En seco (generalmente para material de vidrio)
 En autoclave “121ºC/1 atm” (productos contaminados antes de desechar)
• Área de almacén de productos y reactivos.
• Sección de Bacteriología.
o Se interpretan cultivos, tinciones y otras técnicas, realizando identificación y pruebas de sensibilidad (se refiere a qué tipo de antibiótico es sensible el microorganismo).
o Técnicas de diagnóstico rápido para la detección de Ag/Ac directamente en las muestras:
 Urocultivos (muestra = orina).
 Coprocultivos y parásitos (muestra = heces).
 Exudados y anaeróbios (muestras = secreciones)
 Hemocultivos (muestra = sangre)
• Sección de Micobacterias. Debería estar aislada del resto del laboratorio con el fin de evitar la contaminación del resto del personal
o Identificación y aislamiento de micobacterias (Ej. Tuberculosis).
• Sección de Micología.
o Estudio de infecciones producidas por hongos:
 Unicelulares (levaduras)
 Filamentosos (Mohos)
• Sección de antibióticos.
• Sección de Serología o Inmunomicrobiología.
• Otras secciones: Virología y Biología Molecular.
• NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO.
NORMAS:
• Calidad en las técnicas y en los resultados
• Seguridad e higiene en el trabajo
NIVELES DE SEGURIDAD BIOLÓGICAS según: las técnicas, los equipos de seguridad y la estructura del Laboratorio.
NIVEL 1- Laboratorios de enseñanza: Microorganismos no patógenos y oportunistas (se refiere a aquellos microorganismos que no son capaces de producir enfermedad en un individuo sano, pero si en determinadas condiciones de defensas bajas).
NIVEL 2- Microorganismos de peligrosidad potencialmente moderada.
NIVEL 3- Microorganismos de alto riesgo.
• MATERIAL NECESARIO.
• Medios de cultivo
• Placas de Petri (de vidrio y desechables)
• Morteros de porcelana o vidrio: para muestras de tejidos que necesitan ser machacadas antes de preparar el cultivo.
• Asas de siembra: nos permiten tomar la muestra y realizar la extensión en el medio de cultivo. Pueden ser redondas (al cargarla se forma, por capilaridad, una película en el asa) o pueden ser rectas. Estas últimas sirven para llevar a cabo el “método de siembra en picadura” que sirve para estudiar la movilidad de las bacterias. La movilidad se manifiesta porque hay un crecimiento hacia ambos lados de la línea de siembra.
APARATAJE BÁSICO.
• Cabinas de seguridad: para la siembra de muestras y minimizar en lo posible la contaminación como consecuencia de la manipulación de las muestras (Ej. Formación de aerosoles)
• Estufas de cultivo: sirven para conseguir unas condiciones óptimas de temperatura y permitir el crecimiento de microorganismos.
• Neveras-Congeladores: las neveras sirven para preservar las muestras cuando no se procesan inmediatamente al llegar al Laboratorio (2-8ºC). Los congeladores sirven para conservar las cepas que luego nos servirán para compararlas con otras muestras nuevas.
• Microscopios
• Autoclave
• CONTROL DE CALIDAD.
Va dirigido a comprobar que los aparatos del Laboratorio trabajan adecuadamente. Son muy costosos, por este motivo no se realizan muy continuos, hay que buscar un equilibrio.
Para asegurar la calidad en el Laboratorio hay que actuar sobre cada uno de los procedimientos y materiales utilizados y para ello se utilizan las “normas de calidad”:
• CONTROL DE CALIDAD DE LAS MUESTRAS. Se realiza en base a:
o Manual que establezca las normas para obtener las muestras y el transporte de las mismas.
o Establecer unos horarios fijos para la recepción de las muestras, así como criterios claros para el rechazo de las mismas.
o Evaluar la calidad de las muestras.
o Informar lo más rápidamente posible de los resultados más importantes con el fin de que el médico pueda actuar cuanto antes.
• CONTROL DE CALIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS
• CONTROL DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
o Comerciales y preparados en el Laboratorio:
 Control de esterilidad de cada lote (autoclave o filtrado). En el proceso de esterilización se añadirá 1 placa control si hay menos de 100 unidades y 3 placas control si hay más de 300 unidades. Tras la esterilización las placas, en general, se dejan durante 24 horas a 37ºC, y en caso del “agar sangre” se dejará, además de las 24 horas a 37ºC, otras 24 horas a temperatura ambiente.
 Control de crecimiento: se realiza cada vez que recibimos o preparamos un nuevo lote. Se lleva a cabo a través de un microorganismo control o cepas de colección. Para realizar la siembra se utiliza un inóculo reducido. El inóculo reducido es un “inóculo estándar” del cual hacemos una dilución al 1/10 de una suspensión del microorganismo con turbidez correspondiente al 0,5 de la escala de Mc Farland (la turbidez es proporcional al número de m.o formadores de colonias). Después de preparar el inóculo estándar, se siembra con un asa de 0,001 mL.
 Control de las características selectivas: sembramos m.o que crecen en el medio que estamos controlando y m.o que no crecen en el. Si ambos crecen, el medio de cultivo no es bueno. El medio de cultivo selectivo sólo permite el crecimiento del m.o para el que ha sido creado.
 Control de las características bioquímicas (diferenciales): algunos medios de cultivo tienen en su composición sustancias que permiten un viraje de color dependiendo de la colonia que esté creciendo. Ej. Cuando el medio contiene lactosa, éste nos permite diferenciar entre las bacterias que usan la lactosa (viraje rosa) de las que no la usan (incoloro).
• REACTIVOS DE IDENTIFICACIÓN COMERCIALES O PREPARADOS:
Deben etiquetarse en el primer uso, poner la fecha de preparación y la caducidad. La frecuencia de los controles es la siguiente:
o Catalasa, Oxidasa, Coagulasa: siempre que se empieza o prepara un nuevo lote y semanalmente. Debe hacerse un control positivo y otro negativo.
o Discos de identificación: siempre que se utilice un nuevo lote.
o Colorantes de uso diario: una vez a la semana. Se realiza una tinción de Gram con un m.o que sabemos que es Gram+.
o Cepas control (cepas de colección como las ATCC u otras fuentes comerciales).
Mantenimiento de las cepas control:
 Medio Cistina Tripticasa.
 Agar Tripticasa soja: se realiza una siembra en profundidad y se cierran los tubos con parafina para evitar la contaminación. Se conserva a temperatura ambiente.
 Agar sangre o Agar chocolate: este último se utiliza para m.o delicados. Se obtiene a partir del agar sangre sometido a calentamiento.
 Medio Cooked meat: para m.o anaeróbicos.
 Congelación: se puede realizar o bien a partir de leche descremada o bien a partir de glicerol.
 Liofilización.
• CONTROL DE APARATOS: (Temperatura entre 23-29ºC con una humedad que oscile entre el 30-50%)
• Control de temperatura en estufas, baños, neveras y congeladores. Para este control se realizan gráficos.
• Atmósfera de incubación:
 En estufas de CO2 (Ej. Estreptococos)
 Atmósfera anaeróbia: para m.o anaeróbicos estrictos (necesitan la ausencia total de O2) (Ej. Costridium). Para comprobar la ausencia de oxígeno se utilizan los indicadores.
• Cabinas de flujo laminar: sirven para evitar la contaminación de las muestras, pero no evitan la contaminación del manipulador.
 Cambio periódico de filtros.
 Control de lámparas ultravioletas: proporciona una cierta esterilidad.
• Autoclaves:
 Control de la temperatura del ciclo completo que dependerá de la atm. que se consiga (1atm.) y que vendrá indicada por el aparato (120-125ºC)
 Control de esterilización mediante 2 tipos de procedimientos:
 Biológicos: mensual. Se usan esporas de bacilus (bacteria)
 Químicos: diario-semanal. Se usan indicadores.
• Microscopios: hay que limpiarlos inmediatamente después de usarlos y dejarlos tapados.
• PRUEBAS DE CAPACIDAD: son muestras simuladas con resultados conocidos. Se envían al Laboratorio sin que ellos lo sepan, con un m.o cuyos resultados son conocidos por los que envían el m.o. Luego se emite un comunicado y así se comprueba si realmente el Laboratorio funciona correctamente.
• CONTROL DE CALIDAD EN SEROLOGÍA.
 Pruebas de capacidad para asegurar que el trabajo realizado es correcto.
 Muestras de suero de titulación conocida.
 Control estricto de la caducidad de los reactivos.
• CONTROL DE CALIDAD DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (antibiogramas)
 Control de los medios de cultivo: pH (6,5-7,5), atmósfera de incubación, inóculo utilizado(105), tiempo y temperatura.
 Antibióticos: pruebas de sensibilidad por:
• Difusión: discos (soporte sólido). Con concentración exacta.
 Dilución (en polvo): hay que hidratarlos y así conseguimos la concentración necesaria.
 Cepas control: Staphylococus áureos (Gram+), Escherichia coli (Gram-), Psudomona aeruginosa (Gram+).
• MEDIOS DE CULTIVO. PREPARACIÓN. CRECIMIENTO BACTERIANO
5.1. DEFINICIÓN DE MEDIO DE CULTIVO: Soporte que va a contener los nutrientes necesarios, así como unas condiciones óptimas de pH y humedad que permite el desarrollo y crecimiento de microorganismos. Pueden ser:
• Sólidos: al medio de cultivo sólido se le añade un agente gelificante o solidificante. Se preparan en erlenmeyer, se dejan enfriar y luego se pueden pasar o bien a una placa o bien a un tubo. Los gelificantes más habituales son:
 Agar Agar: es un alga que se caracteriza por ser inerte frente a los microorganismos y porque es líquido a la temperatura de ebullición y solidifica entre los 45-50ºC.
 Gelatina.
• Líquidos o caldos: contiene los nutrientes y, en lugar de añadir el agar, tienen el agua que se utiliza para diluir el medio de cultivo. Se preparan en tubo.
5.2. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
La mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados y éstos se deben conservar de la siguiente forma:
 Frescos, secos, sin luz solar y algunos en nevera (Ej. Salmonella).
 Aperturas y cierres los menos posibles para que los productos no capten humedad.
Cuando los medios son preparados tanto por empresas como por el propio Laboratorio, se deben almacenar teniendo en cuenta:
• La temperatura ha de estar entre 2-8ºC. Se conservarán entorno a 4-6 semanas.
• Si es necesario refundir, se hará al baño María o en autoclave 5 min.
5.3. PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Puesto que la mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados, para su preparación será necesaria la adición de agua destilada o desmineralizada con un pH próximo a 7.
Para preparar el medio de cultivo se utiliza un erlenmeyer limpio y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. El volumen del erlenmeyer deberá ser el doble del volumen de medio de cultivo que queramos preparar.
PASOS A REALIZAR:
• Dependiendo del volumen de medio de cultivo que vayamos a preparar, pesar en un vidrio de reloj la cantidad necesaria del medio de cultivo deshidratado.
• Medir en una probeta la cantidad de agua destilada necesaria.
• Añadir parte del agua a un erlenmeyer adecuado al volumen que vamos a preparar.
• Añadir al erlenmeyer el medio de cultivo.
• Agitar hasta la disolución parcial y calentar un poco.
• Añadir el resto del agua que nos servirá para limpiar la superficie del objeto utilizado para pesar.
• Colocamos el erlenmeyer sobre el mechero, apoyado en una rejilla que permita la difusión del calor y calentamos durante un tiempo que vendrá determinado en el prospecto del producto.
• Por último se debe esterilizar.
Todos los medios de cultivo se preparan en erlenmeyer, independientemente de si es sólido o líquido. Lo que diferencia su preparación es la forma de esterilizar:
• Medios de cultivo SÓLIDOS en PLACA: se preparan y esterilizan en el erlenmeyer. Para la esterilización se coloca un tapón de algodón envuelto en una gasa, tapado con papel y sellado con una cinta adhesiva.
• Medios de cultivo SÓLIDOS O LÍQUIDOS en TUBO: se preparan en el erlenmeyer y se esteriliza en el tubo. Los tubos se llenan con un volumen que oscila entre los 5-10 mL (utilizamos una pipeta), se tapan con un tapón metálico y cubiertos con papel y cinta adhesiva. Se esterilizan colocados en una gradilla, aunque para aumentar la superficie se suelen colocar de forma inclinada.
Existen diferentes formas de esterilizar:
• En Autoclave: 15 min./1 atm./121ºC en caso de material limpio.
20-30 min./1atm/121ºC en caso de material contaminado.
• Filtración: mediante filtros de acetato de celulosa (0,22 m). Algunos nutrientes no pueden aguantar altas temperaturas, por eso se esterilizan primero así.
• Tindalización: 100ºC/30 min. Se utiliza cuando están presentes nutrientes que, por sus características no pueden aguantar altas temperaturas.
• CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
• En función de su consistencia:
• Sólidos: contienen agar (5-10% del total de nutrientes)
• Líquidos: aportamos agua.
• Semisólidos: contienen agar (<5-10%). Se utilizan cuando queremos observar movilidad bacteriana. Se hace en tubo y se utiliza la siembra en picadura con asa recta.
• En función de su composición:
• Empíricos: son aquellos en los que no se conoce exactamente su composición. Ya no se utilizan en los Laboratorios.
• Químicamente definidos: se conoce exactamente la composición y la concentración de cada uno de los nutrientes que componen el medio de cultivo.
• Semisintéticos o complejos: se conoce su composición y concentración pero puede variar de un lote a otro (los más utilizados).
• En función del uso que se le da:
• Enriquecidos: son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden determinadas sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un microorganismo exigente.
• De enriquecimiento: se utilizan solamente cuando se sospecha que el microorganismo de la muestra se encuentra en un número muy pequeño. Se le aporta los nutrientes y se espera que crezcan de 6 a 8 horas. Esto se utiliza, por ejemplo, cuando se sospecha la contaminación en alimentos por Salmonella.
• Diferenciales: incorpora determinadas sustancias que nos permiten diferenciar entre dos tipos de microorganismos. Ej. El agar de sal y manitol: nos permite diferenciar en el caso de los staphylococos, los que utilizan el manitol en su metabolismo de los que no. Si lo utilizan originan ácidos, con lo que el pH disminuye y el indicador vira de color.
• Selectivos: llevan incorporadas determinadas sustancias que inhiben el crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que nos interesa. Ej. Agar de sal y manitol: el NaCl (5%) inhibe el crecimiento de ciertos m.o y facilita el desarrollo de otros que crecen mejor en ese medio.
• Transporte y mantenimiento: se utilizan cuando la muestra no se puede procesar inmediatamente después de haberla tomado.
• CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano necesita de una serie de sustancias y de ambientes que faciliten su desarrollo. Estas características pueden ser:
• FÍSICAS
• Temperatura: teniendo en cuenta la temperatura, podemos clasificar a los microorganismos en:
 Mesófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que pueden oscilar entre los 20-45ºC. Temperatura óptima = 35-37ºC.
 Termófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas superiores a los 45ºC.
 Sicrófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que oscilan entre 0-20ºC.
• PH: el pH óptimo en el que se desarrollan la mayoría de los microorganismos es neutro, que oscila entre 6,5-7,5. Los m.o que se desarrollan a pH = 4 se denominan “acidófilos”.
En ocasiones, como consecuencia del metabolismo bacteriano, se producen residuos que acidifican el medio. Para mantener el medio neutro se utilizan tampones. El más utilizado es el de sales fosfato, que además sirven de alimento a los microorganismos,
• Presión Osmótica: es la presión que se origina por difusión o intercambio de soluciones de diferente concentración a través de una membrana. La mayoría de los microorganismos habitan en medios hipotónicos. Su membrana debe ser selectivamente semipermeable para que se pueda dar ese fenómeno.
• QUÍMICAS
• Oxígeno O2: a pesar de ser un elemento fundamental para la mayoría de los organismos, es bastante tóxico y con efectos corrosivos. Dependiendo de las necesidades de oxígeno que tiene un determinado microorganismo podemos clasificarlos en:
 Aerobios obligados estrictos: su metabolismo no puede desarrollarse en un medio sin oxígeno.
 Anaerobios facultativos: son capaces de realizar sus actividades metabólicas tanto en presencia como en ausencia de oxígeno
 Anaerobios estrictos: solamente son capaces de realizar sus funciones metabólicas cuando hay ausencia total de oxígeno, ya que su presencia es letal.
 Anaerobio aereotolerantes: no utilizan el oxígeno para el funcionamiento celular pero son capaces de desarrollarse en su presencia.
 Microaerofílicos: necesitan el oxígeno pero en pequeñas concentraciones.
• Carbono: es un elemento que forma parte de la estructura básica de la materia viva. Las fuentes a partir de las cuales los m.o obtienen este elemento son:
 Las proteínas (en forma de peptonas. Sirve para diferenciar m.o, por ejemplo, cuando tenemos un medio de cultivo con lactosa y peptonas).
 Los hidratos de carbono (fundamentalmente la glucosa y la lactosa. Se usa cuando no nos importa el tipo de m.o que crezca en ese cultivo).
 Los lípidos.
• Nitrógeno, Fósforo y Azufre:
o Nitrógeno: se necesita fundamentalmente para la síntesis de proteínas, es decir, para formar el grupo amino de los aminoácidos, pero también se utiliza para crear el DNA y el RNA. Las fuentes de obtención del nitrógeno son:
 Degradando material proteico e incorporando ese N a su metabolismo.
 Ión amonio NH4+
 Nitratos: algunos organismos liberan ión nitrato NO3- y ellas lo aprovechan.
 N2 gaseoso directo de la atmósfera.
o Azufre: se utiliza para sintetizar aminoácidos y vitaminas.
o Fósforo: la bacteria lo utiliza para sintetizar ácidos nucleicos y fosfolípidos de las membranas nucleares.
• Potasio, Magnesio, Calcio: Su función principal es que son necesarios como cofactores de las enzimas. Una enzima tiene una parte proteica (apoenzimas) y otra no proteica (cofactor). Esta última puede ser un ión metálico o una molécula orgánica compleja llamada coenzima. Los cofactores pueden dar o aceptar átomos requeridos por el sustrato.
• Oligoelementos: Hierro, Cobre, Zinc,. Participan como cofactores de las enzimas.
• Factores orgánicos de crecimiento: Compuestos orgánicos esenciales que el organismo es incapaz de sintetizar.
• DIVISIÓN BACTERIANA
La mayoría de las bacterias se dividen por “fisión binaria”, es decir que cada célula se divide dando lugar a otra idéntica.
FASES
• Elongación celular y duplicación del DNA cromosómico.
• La pared celular y la membrana plasmática, en la zona más próxima al centro se invaginan separando en dos regiones el DNA cromosómico.
• Las paredes en crecimiento se unen formándose dos células individuales.
Algunas especies de microorganismos, en lugar de reproducirse por fisión binaria, lo hacen por “Gemación”: se forma una protuberancia que aumenta de tamaño hasta que se aproxima al de la célula parental, separándose en ese momento. Así se reproducen las levaduras, que son un tipo de hongos unicelulares:
El otro tipo de hongos son los filamentosos, que se van a dividir mediante esporas situadas en los extremos de los filamentos.
• TIEMPO DE GENERACIÓN
Es el tiempo necesario para que una célula se divida. En la mayoría de las bacterias, ese tiempo es de 3 horas, aunque es variable, por ejemplo, el E. Coli tarda sólo 20 min. En dividirse, mientras que otras tardan más de 3 horas.
• FASES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
• Latencia: horas o días. El microorganismo se adapta al medio. Hay un aumento de la actividad metabólica del microorganismo que se traduce en la síntesis de enzimas.
• Logarítmica o crecimiento exponencial: la bacteria está perfectamente adaptada al medio y se reproduce con la máxima actividad. Comienzan a manifestarse en la bacteria características visibles como el color y su actividad metabólica es muy activa.
• Estacionaria: es una fase de equilibrio que a la vez que se reproducen van muriendo en aproximadamente el mismo número. Se producen productos tóxicos debido a la propia muerte de las bacterias y a otros productos de desecho. Como consecuencia se agotan los nutrientes y cesa la reproducción.
• Declive: muerte de las bacterias debido a lo anterior.
5.9. MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO. 2 Métodos:
• Métodos que se basan en el recuento del número de células presentes en una muestra. Generalmente se cuentan los m.o presentes en 0,1 mL o 1 mL en caso de ser muestras líquidas, o en 1 gramo en caso de que sean sólidas.
• Métodos que miden la masa total de la población de microorganismo. Esta masa será directamente proporcional al número de células.
Para el recuento de células se pueden utilizar tanto métodos DIRECTOS como INDIRECTOS.
MÉTODOS DIRECTOS
• RECUENTO EN PLACA: hay que tener en cuenta que cada bacteria va a dar lugar a una colonia. Solamente contaremos aquellas placas en las cuales el número de colonias se encuentre comprendido entre 30-300.
Supongamos que tenemos una muestra en la cual hay 10.000 bacterias en 1mL. Como se formarían 10.000 colonias y éstas no se pueden contar en 1 placa, se tiene que diluir. Por ejemplo, diluimos a 1/10: tomamos 1mL de la muestra y 9ml de disolvente. Ahora tendríamos 1.000 bacterias en 1ml por lo que será necesario diluir otra vez a 1/10 con lo que nos quedaríamos con 100 bacterias en 1mL que ya podemos contar en la placa.
Una vez realizada la dilución seriada pertinente hay que llevarlo a un medio de cultivo. Esto se puede hacer por dos métodos:
• Siembra en masa:
• A partir de las disoluciones seriadas preparadas tomamos 1mL de cada una de ellas y lo depositamos en distintas placas de Petri vacías y estériles.
• Después añadimos un determinado volumen del medio de cultivo (10-20 mL) que tenemos en un baño María para evitar que se solidifique y agitamos la placa sobre la superficie de la mesa para homogeneizar y que las bacterias se distribuyan por toda la superficie de la placa.
• Dejamos solidificar y luego incubamos en la estufa durante 24 horas a 37ºC.
• Transcurrido el tiempo realizamos el recuento. Vamos intentando contar las placas con las diferentes concentraciones de microorganismos hasta que damos con aquella en la que el número de m.o es el adecuado para poder ser contado. Supongamos que hay 270 unidades formadoras de colonia en la 4ª placa. ¿Cuál sería el número total de UFC por mL? Pues multiplicaríamos 270 por las diluciones 1/10 cuatro veces, es decir, por 10.000, por lo que el número total de microorganismos en 1 mL era de 2.700.000.
• Siembra en superficie:
• El medio de cultivo ya está solidificado en la placa.
• Preparamos las disoluciones seriadas y añadimos a cada placa 1 mL
• Para extender sobre la superficie de la placa el mL se utiliza un asa de “Drigalski” que se fabrica con pipetas Pasteur, calentando y doblándola. Debe estar esterilizada- La situamos en el centro de la placa y la giramos en círculo.
Con este método se pueden diferenciar los microorganismos ya que son claras las características de color u otras características de la colonia. Además nos ofrece la posibilidad de realizar la siembra desde las diluciones, cuando se sospecha que el número de diluciones es muy alto o si creemos que es bajo, se puede realizar directamente desde la muestra sin diluir.
• RECUENTO POR FILTRACIÓN: se utilizan habitualmente cuando el microorganismo está en muy pequeña cantidad en la muestra y se necesita mucho volumen de muestra. Para ello pasamos un determinado volumen de ésta (aprox. 100mL) a través de un filtro que no deja pasar a los m.o y se filtra al vacío (generalmente el diámetro del poro es de 0,05 m, aunque depende del tipo de m.o). Retiramos el filtro con unas pinzas estériles y lo depositamos directamente sobre el medio de cultivo. Incubamos y transcurrido el tiempo necesario realizamos el recuento.
• MÉTODO DE N.M.P. (Número más Frecuente): basado en un método estadístico. Dependiendo del número de m.o que sospechamos que puede tener la muestra existen distintas tablas de trabajo de números más probables. Se utiliza sobre todo en la industria, para el análisis de agua.
• MÉTODO DE RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO:
 Se basa en contar la superficie de un cuadrado de 1 cm de lado dibujado en un portaobjetos en el que hemos depositado 0,1 mL de muestra. Habría que contar el mayor número de campos posible y hacer una media teniendo en cuenta la cantidad añadida y el área del cuadrado.
 Utilizando una cámara de recuento.

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