• ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
Está en función del tamaño y de la cantidad de trabajo que en él se realice. Está dividido en secciones y éstas pueden estar individualizadas o bien todas juntas.
Secciones del Laboratorio de Microbiología:
• Sección de toma de muestras: se toman las muestras a pacientes ambulatorios; allí se almacena el material necesario para la toma, que deberá ser revisado y repuesto periódicamente.
• Recepción y registro de muestras (independientemente del lugar donde se hayan recogido las muestras).
o Registro y asignación de un número o código.
o Primera evaluación de las muestras: las muestras, dependiendo del análisis que se vaya a realizar, deben cumplir una serie de requisitos y características fijadas en el Laboratorio. Se deben rechazar las que no cumplan ese criterio pues es posible que los resultados no sean correctos.
• Sección de siembra de muestras
o Procesamiento inicial
 Siembra (en el medio de cultivo más adecuado)
 Tinción (en colorantes ácidos o básicos)
 Técnicas especiales
o Esquemas claros del procesamiento rutinario y procedimientos especiales: no son iguales de un Laboratorio a otro. Dependerá de la experiencia del profesional, entre otras cosas.
• Sección de medios de cultivo
o Preparación y lavado del material.
o Esterilización (tanto de los medios de cultivo como de los productos de desecho).
 En seco (generalmente para material de vidrio)
 En autoclave “121ºC/1 atm” (productos contaminados antes de desechar)
• Área de almacén de productos y reactivos.
• Sección de Bacteriología.
o Se interpretan cultivos, tinciones y otras técnicas, realizando identificación y pruebas de sensibilidad (se refiere a qué tipo de antibiótico es sensible el microorganismo).
o Técnicas de diagnóstico rápido para la detección de Ag/Ac directamente en las muestras:
 Urocultivos (muestra = orina).
 Coprocultivos y parásitos (muestra = heces).
 Exudados y anaeróbios (muestras = secreciones)
 Hemocultivos (muestra = sangre)
• Sección de Micobacterias. Debería estar aislada del resto del laboratorio con el fin de evitar la contaminación del resto del personal
o Identificación y aislamiento de micobacterias (Ej. Tuberculosis).
• Sección de Micología.
o Estudio de infecciones producidas por hongos:
 Unicelulares (levaduras)
 Filamentosos (Mohos)
• Sección de antibióticos.
• Sección de Serología o Inmunomicrobiología.
• Otras secciones: Virología y Biología Molecular.
• NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO.
NORMAS:
• Calidad en las técnicas y en los resultados
• Seguridad e higiene en el trabajo
NIVELES DE SEGURIDAD BIOLÓGICAS según: las técnicas, los equipos de seguridad y la estructura del Laboratorio.
NIVEL 1- Laboratorios de enseñanza: Microorganismos no patógenos y oportunistas (se refiere a aquellos microorganismos que no son capaces de producir enfermedad en un individuo sano, pero si en determinadas condiciones de defensas bajas).
NIVEL 2- Microorganismos de peligrosidad potencialmente moderada.
NIVEL 3- Microorganismos de alto riesgo.
• MATERIAL NECESARIO.
• Medios de cultivo
• Placas de Petri (de vidrio y desechables)
• Morteros de porcelana o vidrio: para muestras de tejidos que necesitan ser machacadas antes de preparar el cultivo.
• Asas de siembra: nos permiten tomar la muestra y realizar la extensión en el medio de cultivo. Pueden ser redondas (al cargarla se forma, por capilaridad, una película en el asa) o pueden ser rectas. Estas últimas sirven para llevar a cabo el “método de siembra en picadura” que sirve para estudiar la movilidad de las bacterias. La movilidad se manifiesta porque hay un crecimiento hacia ambos lados de la línea de siembra.
APARATAJE BÁSICO.
• Cabinas de seguridad: para la siembra de muestras y minimizar en lo posible la contaminación como consecuencia de la manipulación de las muestras (Ej. Formación de aerosoles)
• Estufas de cultivo: sirven para conseguir unas condiciones óptimas de temperatura y permitir el crecimiento de microorganismos.
• Neveras-Congeladores: las neveras sirven para preservar las muestras cuando no se procesan inmediatamente al llegar al Laboratorio (2-8ºC). Los congeladores sirven para conservar las cepas que luego nos servirán para compararlas con otras muestras nuevas.
• Microscopios
• Autoclave
• CONTROL DE CALIDAD.
Va dirigido a comprobar que los aparatos del Laboratorio trabajan adecuadamente. Son muy costosos, por este motivo no se realizan muy continuos, hay que buscar un equilibrio.
Para asegurar la calidad en el Laboratorio hay que actuar sobre cada uno de los procedimientos y materiales utilizados y para ello se utilizan las “normas de calidad”:
• CONTROL DE CALIDAD DE LAS MUESTRAS. Se realiza en base a:
o Manual que establezca las normas para obtener las muestras y el transporte de las mismas.
o Establecer unos horarios fijos para la recepción de las muestras, así como criterios claros para el rechazo de las mismas.
o Evaluar la calidad de las muestras.
o Informar lo más rápidamente posible de los resultados más importantes con el fin de que el médico pueda actuar cuanto antes.
• CONTROL DE CALIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS
• CONTROL DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
o Comerciales y preparados en el Laboratorio:
 Control de esterilidad de cada lote (autoclave o filtrado). En el proceso de esterilización se añadirá 1 placa control si hay menos de 100 unidades y 3 placas control si hay más de 300 unidades. Tras la esterilización las placas, en general, se dejan durante 24 horas a 37ºC, y en caso del “agar sangre” se dejará, además de las 24 horas a 37ºC, otras 24 horas a temperatura ambiente.
 Control de crecimiento: se realiza cada vez que recibimos o preparamos un nuevo lote. Se lleva a cabo a través de un microorganismo control o cepas de colección. Para realizar la siembra se utiliza un inóculo reducido. El inóculo reducido es un “inóculo estándar” del cual hacemos una dilución al 1/10 de una suspensión del microorganismo con turbidez correspondiente al 0,5 de la escala de Mc Farland (la turbidez es proporcional al número de m.o formadores de colonias). Después de preparar el inóculo estándar, se siembra con un asa de 0,001 mL.
 Control de las características selectivas: sembramos m.o que crecen en el medio que estamos controlando y m.o que no crecen en el. Si ambos crecen, el medio de cultivo no es bueno. El medio de cultivo selectivo sólo permite el crecimiento del m.o para el que ha sido creado.
 Control de las características bioquímicas (diferenciales): algunos medios de cultivo tienen en su composición sustancias que permiten un viraje de color dependiendo de la colonia que esté creciendo. Ej. Cuando el medio contiene lactosa, éste nos permite diferenciar entre las bacterias que usan la lactosa (viraje rosa) de las que no la usan (incoloro).
• REACTIVOS DE IDENTIFICACIÓN COMERCIALES O PREPARADOS:
Deben etiquetarse en el primer uso, poner la fecha de preparación y la caducidad. La frecuencia de los controles es la siguiente:
o Catalasa, Oxidasa, Coagulasa: siempre que se empieza o prepara un nuevo lote y semanalmente. Debe hacerse un control positivo y otro negativo.
o Discos de identificación: siempre que se utilice un nuevo lote.
o Colorantes de uso diario: una vez a la semana. Se realiza una tinción de Gram con un m.o que sabemos que es Gram+.
o Cepas control (cepas de colección como las ATCC u otras fuentes comerciales).
Mantenimiento de las cepas control:
 Medio Cistina Tripticasa.
 Agar Tripticasa soja: se realiza una siembra en profundidad y se cierran los tubos con parafina para evitar la contaminación. Se conserva a temperatura ambiente.
 Agar sangre o Agar chocolate: este último se utiliza para m.o delicados. Se obtiene a partir del agar sangre sometido a calentamiento.
 Medio Cooked meat: para m.o anaeróbicos.
 Congelación: se puede realizar o bien a partir de leche descremada o bien a partir de glicerol.
 Liofilización.
• CONTROL DE APARATOS: (Temperatura entre 23-29ºC con una humedad que oscile entre el 30-50%)
• Control de temperatura en estufas, baños, neveras y congeladores. Para este control se realizan gráficos.
• Atmósfera de incubación:
 En estufas de CO2 (Ej. Estreptococos)
 Atmósfera anaeróbia: para m.o anaeróbicos estrictos (necesitan la ausencia total de O2) (Ej. Costridium). Para comprobar la ausencia de oxígeno se utilizan los indicadores.
• Cabinas de flujo laminar: sirven para evitar la contaminación de las muestras, pero no evitan la contaminación del manipulador.
 Cambio periódico de filtros.
 Control de lámparas ultravioletas: proporciona una cierta esterilidad.
• Autoclaves:
 Control de la temperatura del ciclo completo que dependerá de la atm. que se consiga (1atm.) y que vendrá indicada por el aparato (120-125ºC)
 Control de esterilización mediante 2 tipos de procedimientos:
 Biológicos: mensual. Se usan esporas de bacilus (bacteria)
 Químicos: diario-semanal. Se usan indicadores.
• Microscopios: hay que limpiarlos inmediatamente después de usarlos y dejarlos tapados.
• PRUEBAS DE CAPACIDAD: son muestras simuladas con resultados conocidos. Se envían al Laboratorio sin que ellos lo sepan, con un m.o cuyos resultados son conocidos por los que envían el m.o. Luego se emite un comunicado y así se comprueba si realmente el Laboratorio funciona correctamente.
• CONTROL DE CALIDAD EN SEROLOGÍA.
 Pruebas de capacidad para asegurar que el trabajo realizado es correcto.
 Muestras de suero de titulación conocida.
 Control estricto de la caducidad de los reactivos.
• CONTROL DE CALIDAD DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (antibiogramas)
 Control de los medios de cultivo: pH (6,5-7,5), atmósfera de incubación, inóculo utilizado(105), tiempo y temperatura.
 Antibióticos: pruebas de sensibilidad por:
• Difusión: discos (soporte sólido). Con concentración exacta.
 Dilución (en polvo): hay que hidratarlos y así conseguimos la concentración necesaria.
 Cepas control: Staphylococus áureos (Gram+), Escherichia coli (Gram-), Psudomona aeruginosa (Gram+).
• MEDIOS DE CULTIVO. PREPARACIÓN. CRECIMIENTO BACTERIANO
5.1. DEFINICIÓN DE MEDIO DE CULTIVO: Soporte que va a contener los nutrientes necesarios, así como unas condiciones óptimas de pH y humedad que permite el desarrollo y crecimiento de microorganismos. Pueden ser:
• Sólidos: al medio de cultivo sólido se le añade un agente gelificante o solidificante. Se preparan en erlenmeyer, se dejan enfriar y luego se pueden pasar o bien a una placa o bien a un tubo. Los gelificantes más habituales son:
 Agar Agar: es un alga que se caracteriza por ser inerte frente a los microorganismos y porque es líquido a la temperatura de ebullición y solidifica entre los 45-50ºC.
 Gelatina.
• Líquidos o caldos: contiene los nutrientes y, en lugar de añadir el agar, tienen el agua que se utiliza para diluir el medio de cultivo. Se preparan en tubo.
5.2. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
La mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados y éstos se deben conservar de la siguiente forma:
 Frescos, secos, sin luz solar y algunos en nevera (Ej. Salmonella).
 Aperturas y cierres los menos posibles para que los productos no capten humedad.
Cuando los medios son preparados tanto por empresas como por el propio Laboratorio, se deben almacenar teniendo en cuenta:
• La temperatura ha de estar entre 2-8ºC. Se conservarán entorno a 4-6 semanas.
• Si es necesario refundir, se hará al baño María o en autoclave 5 min.
5.3. PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
Puesto que la mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados, para su preparación será necesaria la adición de agua destilada o desmineralizada con un pH próximo a 7.
Para preparar el medio de cultivo se utiliza un erlenmeyer limpio y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. El volumen del erlenmeyer deberá ser el doble del volumen de medio de cultivo que queramos preparar.
PASOS A REALIZAR:
• Dependiendo del volumen de medio de cultivo que vayamos a preparar, pesar en un vidrio de reloj la cantidad necesaria del medio de cultivo deshidratado.
• Medir en una probeta la cantidad de agua destilada necesaria.
• Añadir parte del agua a un erlenmeyer adecuado al volumen que vamos a preparar.
• Añadir al erlenmeyer el medio de cultivo.
• Agitar hasta la disolución parcial y calentar un poco.
• Añadir el resto del agua que nos servirá para limpiar la superficie del objeto utilizado para pesar.
• Colocamos el erlenmeyer sobre el mechero, apoyado en una rejilla que permita la difusión del calor y calentamos durante un tiempo que vendrá determinado en el prospecto del producto.
• Por último se debe esterilizar.
Todos los medios de cultivo se preparan en erlenmeyer, independientemente de si es sólido o líquido. Lo que diferencia su preparación es la forma de esterilizar:
• Medios de cultivo SÓLIDOS en PLACA: se preparan y esterilizan en el erlenmeyer. Para la esterilización se coloca un tapón de algodón envuelto en una gasa, tapado con papel y sellado con una cinta adhesiva.
• Medios de cultivo SÓLIDOS O LÍQUIDOS en TUBO: se preparan en el erlenmeyer y se esteriliza en el tubo. Los tubos se llenan con un volumen que oscila entre los 5-10 mL (utilizamos una pipeta), se tapan con un tapón metálico y cubiertos con papel y cinta adhesiva. Se esterilizan colocados en una gradilla, aunque para aumentar la superficie se suelen colocar de forma inclinada.
Existen diferentes formas de esterilizar:
• En Autoclave: 15 min./1 atm./121ºC en caso de material limpio.
20-30 min./1atm/121ºC en caso de material contaminado.
• Filtración: mediante filtros de acetato de celulosa (0,22 m). Algunos nutrientes no pueden aguantar altas temperaturas, por eso se esterilizan primero así.
• Tindalización: 100ºC/30 min. Se utiliza cuando están presentes nutrientes que, por sus características no pueden aguantar altas temperaturas.
• CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
• En función de su consistencia:
• Sólidos: contienen agar (5-10% del total de nutrientes)
• Líquidos: aportamos agua.
• Semisólidos: contienen agar (<5-10%). Se utilizan cuando queremos observar movilidad bacteriana. Se hace en tubo y se utiliza la siembra en picadura con asa recta.
• En función de su composición:
• Empíricos: son aquellos en los que no se conoce exactamente su composición. Ya no se utilizan en los Laboratorios.
• Químicamente definidos: se conoce exactamente la composición y la concentración de cada uno de los nutrientes que componen el medio de cultivo.
• Semisintéticos o complejos: se conoce su composición y concentración pero puede variar de un lote a otro (los más utilizados).
• En función del uso que se le da:
• Enriquecidos: son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden determinadas sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un microorganismo exigente.
• De enriquecimiento: se utilizan solamente cuando se sospecha que el microorganismo de la muestra se encuentra en un número muy pequeño. Se le aporta los nutrientes y se espera que crezcan de 6 a 8 horas. Esto se utiliza, por ejemplo, cuando se sospecha la contaminación en alimentos por Salmonella.
• Diferenciales: incorpora determinadas sustancias que nos permiten diferenciar entre dos tipos de microorganismos. Ej. El agar de sal y manitol: nos permite diferenciar en el caso de los staphylococos, los que utilizan el manitol en su metabolismo de los que no. Si lo utilizan originan ácidos, con lo que el pH disminuye y el indicador vira de color.
• Selectivos: llevan incorporadas determinadas sustancias que inhiben el crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que nos interesa. Ej. Agar de sal y manitol: el NaCl (5%) inhibe el crecimiento de ciertos m.o y facilita el desarrollo de otros que crecen mejor en ese medio.
• Transporte y mantenimiento: se utilizan cuando la muestra no se puede procesar inmediatamente después de haberla tomado.
• CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano necesita de una serie de sustancias y de ambientes que faciliten su desarrollo. Estas características pueden ser:
• FÍSICAS
• Temperatura: teniendo en cuenta la temperatura, podemos clasificar a los microorganismos en:
 Mesófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que pueden oscilar entre los 20-45ºC. Temperatura óptima = 35-37ºC.
 Termófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas superiores a los 45ºC.
 Sicrófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que oscilan entre 0-20ºC.
• PH: el pH óptimo en el que se desarrollan la mayoría de los microorganismos es neutro, que oscila entre 6,5-7,5. Los m.o que se desarrollan a pH = 4 se denominan “acidófilos”.
En ocasiones, como consecuencia del metabolismo bacteriano, se producen residuos que acidifican el medio. Para mantener el medio neutro se utilizan tampones. El más utilizado es el de sales fosfato, que además sirven de alimento a los microorganismos,
• Presión Osmótica: es la presión que se origina por difusión o intercambio de soluciones de diferente concentración a través de una membrana. La mayoría de los microorganismos habitan en medios hipotónicos. Su membrana debe ser selectivamente semipermeable para que se pueda dar ese fenómeno.
• QUÍMICAS
• Oxígeno O2: a pesar de ser un elemento fundamental para la mayoría de los organismos, es bastante tóxico y con efectos corrosivos. Dependiendo de las necesidades de oxígeno que tiene un determinado microorganismo podemos clasificarlos en:
 Aerobios obligados estrictos: su metabolismo no puede desarrollarse en un medio sin oxígeno.
 Anaerobios facultativos: son capaces de realizar sus actividades metabólicas tanto en presencia como en ausencia de oxígeno
 Anaerobios estrictos: solamente son capaces de realizar sus funciones metabólicas cuando hay ausencia total de oxígeno, ya que su presencia es letal.
 Anaerobio aereotolerantes: no utilizan el oxígeno para el funcionamiento celular pero son capaces de desarrollarse en su presencia.
 Microaerofílicos: necesitan el oxígeno pero en pequeñas concentraciones.
• Carbono: es un elemento que forma parte de la estructura básica de la materia viva. Las fuentes a partir de las cuales los m.o obtienen este elemento son:
 Las proteínas (en forma de peptonas. Sirve para diferenciar m.o, por ejemplo, cuando tenemos un medio de cultivo con lactosa y peptonas).
 Los hidratos de carbono (fundamentalmente la glucosa y la lactosa. Se usa cuando no nos importa el tipo de m.o que crezca en ese cultivo).
 Los lípidos.
• Nitrógeno, Fósforo y Azufre:
o Nitrógeno: se necesita fundamentalmente para la síntesis de proteínas, es decir, para formar el grupo amino de los aminoácidos, pero también se utiliza para crear el DNA y el RNA. Las fuentes de obtención del nitrógeno son:
 Degradando material proteico e incorporando ese N a su metabolismo.
 Ión amonio NH4+
 Nitratos: algunos organismos liberan ión nitrato NO3- y ellas lo aprovechan.
 N2 gaseoso directo de la atmósfera.
o Azufre: se utiliza para sintetizar aminoácidos y vitaminas.
o Fósforo: la bacteria lo utiliza para sintetizar ácidos nucleicos y fosfolípidos de las membranas nucleares.
• Potasio, Magnesio, Calcio: Su función principal es que son necesarios como cofactores de las enzimas. Una enzima tiene una parte proteica (apoenzimas) y otra no proteica (cofactor). Esta última puede ser un ión metálico o una molécula orgánica compleja llamada coenzima. Los cofactores pueden dar o aceptar átomos requeridos por el sustrato.
• Oligoelementos: Hierro, Cobre, Zinc,. Participan como cofactores de las enzimas.
• Factores orgánicos de crecimiento: Compuestos orgánicos esenciales que el organismo es incapaz de sintetizar.
• DIVISIÓN BACTERIANA
La mayoría de las bacterias se dividen por “fisión binaria”, es decir que cada célula se divide dando lugar a otra idéntica.
FASES
• Elongación celular y duplicación del DNA cromosómico.
• La pared celular y la membrana plasmática, en la zona más próxima al centro se invaginan separando en dos regiones el DNA cromosómico.
• Las paredes en crecimiento se unen formándose dos células individuales.
Algunas especies de microorganismos, en lugar de reproducirse por fisión binaria, lo hacen por “Gemación”: se forma una protuberancia que aumenta de tamaño hasta que se aproxima al de la célula parental, separándose en ese momento. Así se reproducen las levaduras, que son un tipo de hongos unicelulares:
El otro tipo de hongos son los filamentosos, que se van a dividir mediante esporas situadas en los extremos de los filamentos.
• TIEMPO DE GENERACIÓN
Es el tiempo necesario para que una célula se divida. En la mayoría de las bacterias, ese tiempo es de 3 horas, aunque es variable, por ejemplo, el E. Coli tarda sólo 20 min. En dividirse, mientras que otras tardan más de 3 horas.
• FASES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
• Latencia: horas o días. El microorganismo se adapta al medio. Hay un aumento de la actividad metabólica del microorganismo que se traduce en la síntesis de enzimas.
• Logarítmica o crecimiento exponencial: la bacteria está perfectamente adaptada al medio y se reproduce con la máxima actividad. Comienzan a manifestarse en la bacteria características visibles como el color y su actividad metabólica es muy activa.
• Estacionaria: es una fase de equilibrio que a la vez que se reproducen van muriendo en aproximadamente el mismo número. Se producen productos tóxicos debido a la propia muerte de las bacterias y a otros productos de desecho. Como consecuencia se agotan los nutrientes y cesa la reproducción.
• Declive: muerte de las bacterias debido a lo anterior.
5.9. MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO. 2 Métodos:
• Métodos que se basan en el recuento del número de células presentes en una muestra. Generalmente se cuentan los m.o presentes en 0,1 mL o 1 mL en caso de ser muestras líquidas, o en 1 gramo en caso de que sean sólidas.
• Métodos que miden la masa total de la población de microorganismo. Esta masa será directamente proporcional al número de células.
Para el recuento de células se pueden utilizar tanto métodos DIRECTOS como INDIRECTOS.
MÉTODOS DIRECTOS
• RECUENTO EN PLACA: hay que tener en cuenta que cada bacteria va a dar lugar a una colonia. Solamente contaremos aquellas placas en las cuales el número de colonias se encuentre comprendido entre 30-300.
Supongamos que tenemos una muestra en la cual hay 10.000 bacterias en 1mL. Como se formarían 10.000 colonias y éstas no se pueden contar en 1 placa, se tiene que diluir. Por ejemplo, diluimos a 1/10: tomamos 1mL de la muestra y 9ml de disolvente. Ahora tendríamos 1.000 bacterias en 1ml por lo que será necesario diluir otra vez a 1/10 con lo que nos quedaríamos con 100 bacterias en 1mL que ya podemos contar en la placa.
Una vez realizada la dilución seriada pertinente hay que llevarlo a un medio de cultivo. Esto se puede hacer por dos métodos:
• Siembra en masa:
• A partir de las disoluciones seriadas preparadas tomamos 1mL de cada una de ellas y lo depositamos en distintas placas de Petri vacías y estériles.
• Después añadimos un determinado volumen del medio de cultivo (10-20 mL) que tenemos en un baño María para evitar que se solidifique y agitamos la placa sobre la superficie de la mesa para homogeneizar y que las bacterias se distribuyan por toda la superficie de la placa.
• Dejamos solidificar y luego incubamos en la estufa durante 24 horas a 37ºC.
• Transcurrido el tiempo realizamos el recuento. Vamos intentando contar las placas con las diferentes concentraciones de microorganismos hasta que damos con aquella en la que el número de m.o es el adecuado para poder ser contado. Supongamos que hay 270 unidades formadoras de colonia en la 4ª placa. ¿Cuál sería el número total de UFC por mL? Pues multiplicaríamos 270 por las diluciones 1/10 cuatro veces, es decir, por 10.000, por lo que el número total de microorganismos en 1 mL era de 2.700.000.
• Siembra en superficie:
• El medio de cultivo ya está solidificado en la placa.
• Preparamos las disoluciones seriadas y añadimos a cada placa 1 mL
• Para extender sobre la superficie de la placa el mL se utiliza un asa de “Drigalski” que se fabrica con pipetas Pasteur, calentando y doblándola. Debe estar esterilizada- La situamos en el centro de la placa y la giramos en círculo.
Con este método se pueden diferenciar los microorganismos ya que son claras las características de color u otras características de la colonia. Además nos ofrece la posibilidad de realizar la siembra desde las diluciones, cuando se sospecha que el número de diluciones es muy alto o si creemos que es bajo, se puede realizar directamente desde la muestra sin diluir.
• RECUENTO POR FILTRACIÓN: se utilizan habitualmente cuando el microorganismo está en muy pequeña cantidad en la muestra y se necesita mucho volumen de muestra. Para ello pasamos un determinado volumen de ésta (aprox. 100mL) a través de un filtro que no deja pasar a los m.o y se filtra al vacío (generalmente el diámetro del poro es de 0,05 m, aunque depende del tipo de m.o). Retiramos el filtro con unas pinzas estériles y lo depositamos directamente sobre el medio de cultivo. Incubamos y transcurrido el tiempo necesario realizamos el recuento.
• MÉTODO DE N.M.P. (Número más Frecuente): basado en un método estadístico. Dependiendo del número de m.o que sospechamos que puede tener la muestra existen distintas tablas de trabajo de números más probables. Se utiliza sobre todo en la industria, para el análisis de agua.
• MÉTODO DE RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO:
 Se basa en contar la superficie de un cuadrado de 1 cm de lado dibujado en un portaobjetos en el que hemos depositado 0,1 mL de muestra. Habría que contar el mayor número de campos posible y hacer una media teniendo en cuenta la cantidad añadida y el área del cuadrado.
 Utilizando una cámara de recuento.

ANALISIS MICROBIOLOGICO-

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO


DE LOS ALIMENTOS

Principios de garantía de la calidad microbiológica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales: Principios ecológicos, Fundamentos de los procedimientos analíticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, daño o lesión subletal, evaluación sistemática de los medios de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra única, toma de muestras representativas. Utilización de microorganismos como marcadores (índices e indicadores).

1. Principios de garantía de la calidad microbiológica de los alimentos.

El análisis microbiológico de alimentos no tiene carácter preventivo sino que simplemente es una inspección que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiológica mediante el análisis microbiológico sino que lo que hay que hacer es determinar en la Industria cuáles son los puntos de riesgo de contaminación o multiplicación microbiana (los llamados Puntos Críticos del proceso) y evitarlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribucción del alimento (BPE).

La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiológica y no en comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relación coste - beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar).

En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un análisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnológicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mínima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asímismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el número de raciones o partes consumidas por la población en un determinado tiempo.

La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la fórmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo.

Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiológica del producto disminuyen y el análisis microbiológico es más consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.





2. Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales.





A.- Principios ecológicos: Es necesario considerar la distribución desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos.

El número de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe limitarse al mínimo necesario para así poder aumentar el número de análisis.

Los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento poque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento.

B.- Fundamentos de los procedimientos analíticos:











B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor más importante en el análisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por los microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las máquinas, sistemas de alimentos heterogéneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinación del modo óptimo de remoción del micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La evitación de la contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestras.

B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca: (a) Multiplicación de los microorganismos presentes y (b) Inactivación de algún microorganismo.

En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0º C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de gérmenes termotrofos.

B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora ésta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones tan bajas.

Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; así como no debe usarse un medio diseñado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecológicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorisión de los resultados.

B.4.- Daño o lesión subletal: Tratamientos tecnológicos pueden producir daños subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios seléctivos. Son necesarios medios de recupe-ración en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carácter y la intensidad del daño infligido, (c) El tipo de alimento en el que esté el microorganismo y (d) El medio selectivo final.

Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperación: recuperación en líquido (2 h. 25º en agua peptona) o en sólido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25º C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo).

B.5.- Evaluación siotemática de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles periódicos que permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de células aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ecométrico.

C. Necesidad de valores de referencia.

Es necesario comparar los resultados con valores microbiológicos de referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones teóricas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la producción del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prácticas de Elaboración).

La Microbiología de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE).

3. Muestreo.

El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al análisis microbiológico.

A. Muestreo único

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida única de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboración y conservación del alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados.

Ningún muestreo único puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbiológicas, aún hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiológicamente defectuoso.

Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un número de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones reales.

Cuando se analiza una muestra única el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las muestras únicas están siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos.

B. Analisis repetido.

Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiológico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de aceptación de lotes substándard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substándard.

Un sistema de muestras basado en el análisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligará al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.

C Planes de muestreo de tres categorías.

Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiológica establecida conforme a los valores microbiológicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores más altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento].

D. Toma de muestras representativas.

Una vez decidido el número de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse éstas de forma estadísticamente representativa utilizando tablas de número al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher.

4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores).





A. Introducción histórica, terminología y bases de su utilización.

Historicamente, desde hace un siglo se estudia la detección de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como índice de contaminación final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi.

B. Terminología

Microorganismo índice: aquél cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo patógeno relacionado ecológicamente con él. (Ej.: E. colí índice de S. typhi).

Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una contaminación posterior del alimento analizado.

Un microorganismo dado puede actuar como índice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patógeno, se siguen llevando a cabo análisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economía, rapidez y sensibilidad.

Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield.









1.

INTRODUCCIÓN:

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos.

Para enjuiciar la calidadde las aguas se recorre a parámetro físico químico y biológico. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos ; es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coli y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación.

Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producciónde gas y ácido. Para determinar el número de estas bacterias se suele emplear medio selectivo de endo.

MARCO TEÓRICO

Bacteria Coliforme:

Incluyen E. Coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en características pequeñas. Las bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombrey animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa y forman ácido y gas.

Son anaeróbios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a gran abundancias en medios corrientes, como caldo y agar.

La colonia de E. Coli en agar E.M.B (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja.

Se han creado otras pruebas para diferenciar tipos de bacterias coliformes, suelen emplearse 4 y se han juntado sus iniciales en la palabra nemotécnica IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Borges – Proskauer (V:P) y utilizada de citrato.

La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli ++ --, significa que el M:O: produce Indol y es positivo al rojo metilo y negativo al V.P.

Hay 16 combinaciones posibles de resultados prueba negativa y positiva.

Se considera que todas las bacterias coliformes, tienen importancia en el H2O desde el punto de vista sanitario aunque muchos autores an tratado de diferenciar el tipo fecal (e.coli) y el nofecal (A: aurogenes)

Análisis sanitario del H2O

El diagnostico de las colonias coliformes en la muestra de H2O se basa en la capacidad de dicho M:O: para producir gas a partir de la lactosa.

Filtración:

Es un medio eficaz de eliminar M.O. y otras sustancias de suspensión del H2O.

Cloración:

Es el método más eficaz de hacer potable el H2O. La cantidad de cloro que se agrega depende del grado de contaminación del abasto hídrico y su contenido de sustancias orgánicas. El cloro mata la mayor parte delas bacterias no esporágenas. El H2O clorada, en consecuencia no siempre es estéril, pero suele brindar seguridad para consumo por el ser humano.

Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Método):

Se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtración de acetatos de celulosacon poros y diámetro tal capte la bacteria, en tanto que permita el paso libre del H2O.

La membrana de filtración se coloca asépticamente en una caja de Petri en un cojincillo absorbente saturado con una sal nutritiva P. Ej., caldo M. Endo, se incuba a 24 ºC durante 24 horas. Después se examina la membrana con microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias verdes violáceos con resplandor metálico, si considera que son bacterias coliformes.

H2O potable:

Sea limpia, fresca, sin olores o sabores desagradables o que causen rechazo de quien lo consume y sin sustancias químicas o M.O. nocivos.

Ventajas del uso de Filtro de membrana para las H2O:

1.

2. Rapidez en la obtención de resultados

3. Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.

4. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fácilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.

Inconvenientes de Uso:

1. No hay indicación de formación de gas (algunas H2O tienen gran cantidad de organismos fermentadores de la lactosa sin producción de gas capaces de crecer en el medio).

2. La filtración por membrana es inadecuada para H2O con mucha turbidez y bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua suficiente.

3. Cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes.

Experimento # 1:

"Contaje de aeróbios totales"

la muestra tomada en una tubería o H2O de chorro, después de haber agregado 10 ml de esta muestra al envase que contenía 0,1 de peptona y con dilución de 10-1, 10-2 y 10-3 , rotulada como Am (10-1, 10-2 y 10-3).

Aquí en este experimento se realizó el paso de siembra en profundidad.

El resultado dio negativo, no hubo presencia de bacteria aeróbios, por lo tanto el contaje de bacterias aerobias totales, no fue posible por lo antes ya mencionado.

Después se dejó por 24 horas mas y tampoco se observó ningún crecimiento, o sea, dio negativa la prueba, es decir, no se determinó la presencia de aeróbios en los experimentos realizados.

Descartamos las placas, pero antes realizamos una inoculación con E.coli; una placa y un tubo.

El agar empleado fue el agar para el recuento.

Este resultado nos indica que la muestra tomada cumple con la norma COVENIN 2614-1994 (1ª revisión) que dice:

5.2.1: es envase previamente esterilizado, debe destaparse únicamente en el momento preciso de la captación y finalizado esta deberá cerrar de inmediato

5.2.2: durante la toma de muestra, el envase deberá sujetarse por la base y evitar cualquier contacto extremo que contamine la tapa o la boca del mismo.

También está H2O, cumple con las normas COVENIN, donde dice en 3.2, que el H2O tratado es aquella que ha sido sometida a uno o varios procesos químicos o físicos para su adecuación como H2O potable.

Experimento # 2

(Coliformes totales)

en esta experiencia la siguientes 6 placas fueron rotuladas (10-1, 10-2 y 10-3), con Agar violeta Rojo Billis (VRBA), a esta placas le agregamos 1 ml de la muestra (a cada una de las 6 placas).

Estas placas la incubamos x 24 horas a 37 ºC, aquí no se presentaron crecimiento de coliforme; el cual nos indica, que el H2O tratado este experimento está debidamente saneada, como lo estipula la norma COVENIN, que el H2O potable debe ser limpia, fresca, sin sabores ni olores desagradables o que cause rechazo de quien la consume.

Esta prueba dio negativa, no hubo crecimiento de bacterias coliforme, por lo ya señalado anteriormente por lo que se considera que el aguaes de calidad o como lo dice COVENIN: agua de calidad es la expresión de todos los factores físicos, químicos y microbiológicos que están presentes en el H2O.

Si la prueba fuese positiva, las colonias tienen que ser roja, dada por los pigmentos.

La finalidad de esta experiencia es de observar crecimiento de coliformes totales, en este caso la Escherichia coli que es la especie clásica de este grupo.

Experimento # 3

Número Mas Probable de Coliformes (NMP)

En este experimento, agarramos 9 tubos con caldo nutriente amarillo, le agregamos 1 ml de la muestra agregada en los envase de 0,1 peptona y rotulada 10-1; 10-2;10-3.

Cada tubo tiene un tubo Durjam invertido en su interior, si en el interior de este tubo, después de 24 horas no hay formación de gas la prueba es negativa, no hubo crecimiento de presunto coliforme, y efectivamente este fue el resultado obtenido, no hubo presencia de gas en el interior del tubo Durjam.

Nota: cada tubo contenía 10 ml de caldo L.S.T.

Con respecto a N.M.P de coliforme COVENIN dice en 7.2.3, se considera tubo positivo en la prueba presuntiva aquellas que presenten cualquier cantidad de gas en el tubo Durham y / o Turbiedad después de 24 a 48 horas de incubación.

Este resultado no fue el nuestro, pero para demostrar lo señalado anteriormente, que si no hay presencia de gas, es porque la prueba es negativa, según COVENIN, o sea, que el H2O utilizada para este análisis ha sido adecuadamente físico o químico analizada, para considerarla agua potable.

Cabe destacar que la estimación del N.M.P., se basa en la presunción de que las bacterias se hallan naturalmente distribuida en un medio líquido.

Experimento # 4

NMP de estreptococos fecales:

Aquí se procedió igual que el experimento # 3, pero aquí se utilizó caldo glucosado (color rojo)cuando la prueba resulta positiva cambia de un color púrpura a amarilla, pero como no hubo reacción de este microorganismo no presentó el color ya señalado, por lo que se puede indicar que no hubo crecimiento de estreptococos fecales.

A pesar de que el medio estaba nutrido con 0,1 peptona, no se presentó crecimiento, ya que H2O está totalmente curada, por los medios requeridos por COVENIN y el desarrollo está totalmente inhibido.

También hay que tener en cuenta que esto es posible, cuando se cumple con las normas o pasos necesarios para una buena toma de muestras para analizar.

Nota:

Los estreptococos fecales son bacterias entéricas que viven en el intestino de los animales de sangrecaliente u del hombre, debido a que S. Fecalis abunda en el intestino grueso del hombre, su presencia en los H2O significa contaminación fecal.

Experimento # 5:

Numeración de organismos mediante técnicas de filtración

Para este experimento se trabajó con agar MacKonkey. Aquí se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtración de acetato de celulosa con poros y diámetro tal (0,45 diámetro) que capte la bacteria en tanto que permita el paso libre del H2O.

La membrana de filtración se coloca asépticamente con una pinza en una caja de Petri en un cojincillo absorbente con una solución nutritiva, y se incuba a 37 ºC a 24 horas.

Después se examina la muestra con un contador de colonias, estas colonias deben ser verdes violáceas con resplandor metálico (bacterias coliformes).

Cabe decir que este experimento fue realizado por la técnica Nubia de Pérez, fue demostrativo, dio positivo, pero como la prueba anterior nos dieron negativas no lo consideramos como punto de discusión.

El H2O tomada para este análisis fue del grupo 6, los resultados de ellos todos dieron positivos.

Esta Técnica tiene muchas aplicaciones útiles:

1. Se puede examinar grandes volúmenes de H2O; teóricamente casi cualquier volumende agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedaran en el disco.

2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar los microorganismos.

3. Se obtienen resultados más rápidos, que con los métodos convencionales.

4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias como coliformes, cuando se usan los medios apropiados.

H2O del "Equipo 6"

• Tomada de un envase fijo (pipote)

• Hora 11 de la mañana.

COVENIN 5.1.3 (2614:1994)

"Para la captación de muestras en depósito estanques u otras H2O confinadas sin corriente apreciable, se sumerge el recipiente invertido y se desplaza en sentido horizontal creando una corriente artificial. Se extrae la muestra y se cierra el recipiente rápidamente".

5.1.4

"Para muestras de H2O confinadas en depósitos, estanques u otros a profundidades específicas se debe utilizar un muestreo, diseñado de manera tal que el H2O fluya a través de un tubo el fondo de envase de recepción"

con respecto a la hora, fecha y lugar donde fue tomada, COVENIN lo señala en 5.5

Objetivo General:

•

• Determinación del número mas probable de bacterias coliformes en agua potable.

• Determina presuntos Streptococcus fecalis en la muestra de agua.

Objetivos Específicos:

• Determinar la veracidad del tratamiento implementado en las H2O potables y hasta que punto reduce el crecimiento de las coliformes.