ANALISIS MICROBIOLOGICO-

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO


DE LOS ALIMENTOS

Principios de garantía de la calidad microbiológica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales: Principios ecológicos, Fundamentos de los procedimientos analíticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, daño o lesión subletal, evaluación sistemática de los medios de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra única, toma de muestras representativas. Utilización de microorganismos como marcadores (índices e indicadores).

1. Principios de garantía de la calidad microbiológica de los alimentos.

El análisis microbiológico de alimentos no tiene carácter preventivo sino que simplemente es una inspección que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiológica mediante el análisis microbiológico sino que lo que hay que hacer es determinar en la Industria cuáles son los puntos de riesgo de contaminación o multiplicación microbiana (los llamados Puntos Críticos del proceso) y evitarlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribucción del alimento (BPE).

La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiológica y no en comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relación coste - beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar).

En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un análisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnológicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mínima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asímismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el número de raciones o partes consumidas por la población en un determinado tiempo.

La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la fórmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo.

Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiológica del producto disminuyen y el análisis microbiológico es más consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.





2. Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales.





A.- Principios ecológicos: Es necesario considerar la distribución desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos.

El número de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe limitarse al mínimo necesario para así poder aumentar el número de análisis.

Los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento poque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de cada tipo de alimento.

B.- Fundamentos de los procedimientos analíticos:











B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor más importante en el análisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por los microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las máquinas, sistemas de alimentos heterogéneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinación del modo óptimo de remoción del micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La evitación de la contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestras.

B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca: (a) Multiplicación de los microorganismos presentes y (b) Inactivación de algún microorganismo.

En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0º C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de gérmenes termotrofos.

B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora ésta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones tan bajas.

Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; así como no debe usarse un medio diseñado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecológicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorisión de los resultados.

B.4.- Daño o lesión subletal: Tratamientos tecnológicos pueden producir daños subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios seléctivos. Son necesarios medios de recupe-ración en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carácter y la intensidad del daño infligido, (c) El tipo de alimento en el que esté el microorganismo y (d) El medio selectivo final.

Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperación: recuperación en líquido (2 h. 25º en agua peptona) o en sólido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25º C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo).

B.5.- Evaluación siotemática de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles periódicos que permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de células aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ecométrico.

C. Necesidad de valores de referencia.

Es necesario comparar los resultados con valores microbiológicos de referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones teóricas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la producción del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prácticas de Elaboración).

La Microbiología de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE).

3. Muestreo.

El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al análisis microbiológico.

A. Muestreo único

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida única de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboración y conservación del alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados.

Ningún muestreo único puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbiológicas, aún hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiológicamente defectuoso.

Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un número de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones reales.

Cuando se analiza una muestra única el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las muestras únicas están siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos.

B. Analisis repetido.

Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiológico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de aceptación de lotes substándard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substándard.

Un sistema de muestras basado en el análisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligará al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.

C Planes de muestreo de tres categorías.

Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiológica establecida conforme a los valores microbiológicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores más altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento].

D. Toma de muestras representativas.

Una vez decidido el número de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse éstas de forma estadísticamente representativa utilizando tablas de número al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher.

4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores).





A. Introducción histórica, terminología y bases de su utilización.

Historicamente, desde hace un siglo se estudia la detección de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como índice de contaminación final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi.

B. Terminología

Microorganismo índice: aquél cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo patógeno relacionado ecológicamente con él. (Ej.: E. colí índice de S. typhi).

Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una contaminación posterior del alimento analizado.

Un microorganismo dado puede actuar como índice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patógeno, se siguen llevando a cabo análisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economía, rapidez y sensibilidad.

Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield.









1.

INTRODUCCIÓN:

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo gram negativos, inmóviles o móviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies forman ácido o ácido y gas a partir de glucosa. Su composición antigénica es un mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos.

Para enjuiciar la calidadde las aguas se recorre a parámetro físico químico y biológico. Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos ; es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coli y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la contaminación.

Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes, pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producciónde gas y ácido. Para determinar el número de estas bacterias se suele emplear medio selectivo de endo.

MARCO TEÓRICO

Bacteria Coliforme:

Incluyen E. Coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en características pequeñas. Las bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombrey animal. E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa y forman ácido y gas.

Son anaeróbios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a gran abundancias en medios corrientes, como caldo y agar.

La colonia de E. Coli en agar E.M.B (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja.

Se han creado otras pruebas para diferenciar tipos de bacterias coliformes, suelen emplearse 4 y se han juntado sus iniciales en la palabra nemotécnica IMViC (Indol, Rojo Metilo (R.M.), Borges – Proskauer (V:P) y utilizada de citrato.

La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E.coli ++ --, significa que el M:O: produce Indol y es positivo al rojo metilo y negativo al V.P.

Hay 16 combinaciones posibles de resultados prueba negativa y positiva.

Se considera que todas las bacterias coliformes, tienen importancia en el H2O desde el punto de vista sanitario aunque muchos autores an tratado de diferenciar el tipo fecal (e.coli) y el nofecal (A: aurogenes)

Análisis sanitario del H2O

El diagnostico de las colonias coliformes en la muestra de H2O se basa en la capacidad de dicho M:O: para producir gas a partir de la lactosa.

Filtración:

Es un medio eficaz de eliminar M.O. y otras sustancias de suspensión del H2O.

Cloración:

Es el método más eficaz de hacer potable el H2O. La cantidad de cloro que se agrega depende del grado de contaminación del abasto hídrico y su contenido de sustancias orgánicas. El cloro mata la mayor parte delas bacterias no esporágenas. El H2O clorada, en consecuencia no siempre es estéril, pero suele brindar seguridad para consumo por el ser humano.

Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Método):

Se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtración de acetatos de celulosacon poros y diámetro tal capte la bacteria, en tanto que permita el paso libre del H2O.

La membrana de filtración se coloca asépticamente en una caja de Petri en un cojincillo absorbente saturado con una sal nutritiva P. Ej., caldo M. Endo, se incuba a 24 ºC durante 24 horas. Después se examina la membrana con microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias verdes violáceos con resplandor metálico, si considera que son bacterias coliformes.

H2O potable:

Sea limpia, fresca, sin olores o sabores desagradables o que causen rechazo de quien lo consume y sin sustancias químicas o M.O. nocivos.

Ventajas del uso de Filtro de membrana para las H2O:

1.

2. Rapidez en la obtención de resultados

3. Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.

4. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fácilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.

Inconvenientes de Uso:

1. No hay indicación de formación de gas (algunas H2O tienen gran cantidad de organismos fermentadores de la lactosa sin producción de gas capaces de crecer en el medio).

2. La filtración por membrana es inadecuada para H2O con mucha turbidez y bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua suficiente.

3. Cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes.

Experimento # 1:

"Contaje de aeróbios totales"

la muestra tomada en una tubería o H2O de chorro, después de haber agregado 10 ml de esta muestra al envase que contenía 0,1 de peptona y con dilución de 10-1, 10-2 y 10-3 , rotulada como Am (10-1, 10-2 y 10-3).

Aquí en este experimento se realizó el paso de siembra en profundidad.

El resultado dio negativo, no hubo presencia de bacteria aeróbios, por lo tanto el contaje de bacterias aerobias totales, no fue posible por lo antes ya mencionado.

Después se dejó por 24 horas mas y tampoco se observó ningún crecimiento, o sea, dio negativa la prueba, es decir, no se determinó la presencia de aeróbios en los experimentos realizados.

Descartamos las placas, pero antes realizamos una inoculación con E.coli; una placa y un tubo.

El agar empleado fue el agar para el recuento.

Este resultado nos indica que la muestra tomada cumple con la norma COVENIN 2614-1994 (1ª revisión) que dice:

5.2.1: es envase previamente esterilizado, debe destaparse únicamente en el momento preciso de la captación y finalizado esta deberá cerrar de inmediato

5.2.2: durante la toma de muestra, el envase deberá sujetarse por la base y evitar cualquier contacto extremo que contamine la tapa o la boca del mismo.

También está H2O, cumple con las normas COVENIN, donde dice en 3.2, que el H2O tratado es aquella que ha sido sometida a uno o varios procesos químicos o físicos para su adecuación como H2O potable.

Experimento # 2

(Coliformes totales)

en esta experiencia la siguientes 6 placas fueron rotuladas (10-1, 10-2 y 10-3), con Agar violeta Rojo Billis (VRBA), a esta placas le agregamos 1 ml de la muestra (a cada una de las 6 placas).

Estas placas la incubamos x 24 horas a 37 ºC, aquí no se presentaron crecimiento de coliforme; el cual nos indica, que el H2O tratado este experimento está debidamente saneada, como lo estipula la norma COVENIN, que el H2O potable debe ser limpia, fresca, sin sabores ni olores desagradables o que cause rechazo de quien la consume.

Esta prueba dio negativa, no hubo crecimiento de bacterias coliforme, por lo ya señalado anteriormente por lo que se considera que el aguaes de calidad o como lo dice COVENIN: agua de calidad es la expresión de todos los factores físicos, químicos y microbiológicos que están presentes en el H2O.

Si la prueba fuese positiva, las colonias tienen que ser roja, dada por los pigmentos.

La finalidad de esta experiencia es de observar crecimiento de coliformes totales, en este caso la Escherichia coli que es la especie clásica de este grupo.

Experimento # 3

Número Mas Probable de Coliformes (NMP)

En este experimento, agarramos 9 tubos con caldo nutriente amarillo, le agregamos 1 ml de la muestra agregada en los envase de 0,1 peptona y rotulada 10-1; 10-2;10-3.

Cada tubo tiene un tubo Durjam invertido en su interior, si en el interior de este tubo, después de 24 horas no hay formación de gas la prueba es negativa, no hubo crecimiento de presunto coliforme, y efectivamente este fue el resultado obtenido, no hubo presencia de gas en el interior del tubo Durjam.

Nota: cada tubo contenía 10 ml de caldo L.S.T.

Con respecto a N.M.P de coliforme COVENIN dice en 7.2.3, se considera tubo positivo en la prueba presuntiva aquellas que presenten cualquier cantidad de gas en el tubo Durham y / o Turbiedad después de 24 a 48 horas de incubación.

Este resultado no fue el nuestro, pero para demostrar lo señalado anteriormente, que si no hay presencia de gas, es porque la prueba es negativa, según COVENIN, o sea, que el H2O utilizada para este análisis ha sido adecuadamente físico o químico analizada, para considerarla agua potable.

Cabe destacar que la estimación del N.M.P., se basa en la presunción de que las bacterias se hallan naturalmente distribuida en un medio líquido.

Experimento # 4

NMP de estreptococos fecales:

Aquí se procedió igual que el experimento # 3, pero aquí se utilizó caldo glucosado (color rojo)cuando la prueba resulta positiva cambia de un color púrpura a amarilla, pero como no hubo reacción de este microorganismo no presentó el color ya señalado, por lo que se puede indicar que no hubo crecimiento de estreptococos fecales.

A pesar de que el medio estaba nutrido con 0,1 peptona, no se presentó crecimiento, ya que H2O está totalmente curada, por los medios requeridos por COVENIN y el desarrollo está totalmente inhibido.

También hay que tener en cuenta que esto es posible, cuando se cumple con las normas o pasos necesarios para una buena toma de muestras para analizar.

Nota:

Los estreptococos fecales son bacterias entéricas que viven en el intestino de los animales de sangrecaliente u del hombre, debido a que S. Fecalis abunda en el intestino grueso del hombre, su presencia en los H2O significa contaminación fecal.

Experimento # 5:

Numeración de organismos mediante técnicas de filtración

Para este experimento se trabajó con agar MacKonkey. Aquí se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtración de acetato de celulosa con poros y diámetro tal (0,45 diámetro) que capte la bacteria en tanto que permita el paso libre del H2O.

La membrana de filtración se coloca asépticamente con una pinza en una caja de Petri en un cojincillo absorbente con una solución nutritiva, y se incuba a 37 ºC a 24 horas.

Después se examina la muestra con un contador de colonias, estas colonias deben ser verdes violáceas con resplandor metálico (bacterias coliformes).

Cabe decir que este experimento fue realizado por la técnica Nubia de Pérez, fue demostrativo, dio positivo, pero como la prueba anterior nos dieron negativas no lo consideramos como punto de discusión.

El H2O tomada para este análisis fue del grupo 6, los resultados de ellos todos dieron positivos.

Esta Técnica tiene muchas aplicaciones útiles:

1. Se puede examinar grandes volúmenes de H2O; teóricamente casi cualquier volumende agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedaran en el disco.

2. La membrana se puede pasar de un medio a otro con el propósito de seleccionar y diferenciar los microorganismos.

3. Se obtienen resultados más rápidos, que con los métodos convencionales.

4. Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias como coliformes, cuando se usan los medios apropiados.

H2O del "Equipo 6"

• Tomada de un envase fijo (pipote)

• Hora 11 de la mañana.

COVENIN 5.1.3 (2614:1994)

"Para la captación de muestras en depósito estanques u otras H2O confinadas sin corriente apreciable, se sumerge el recipiente invertido y se desplaza en sentido horizontal creando una corriente artificial. Se extrae la muestra y se cierra el recipiente rápidamente".

5.1.4

"Para muestras de H2O confinadas en depósitos, estanques u otros a profundidades específicas se debe utilizar un muestreo, diseñado de manera tal que el H2O fluya a través de un tubo el fondo de envase de recepción"

con respecto a la hora, fecha y lugar donde fue tomada, COVENIN lo señala en 5.5

Objetivo General:

•

• Determinación del número mas probable de bacterias coliformes en agua potable.

• Determina presuntos Streptococcus fecalis en la muestra de agua.

Objetivos Específicos:

• Determinar la veracidad del tratamiento implementado en las H2O potables y hasta que punto reduce el crecimiento de las coliformes.